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CRISPR技術(shù)應(yīng)用及成功的關(guān)鍵點(diǎn),PCR Clean™助力科研

更新時(shí)間:2023-09-23  |  點(diǎn)擊率:558

CRISPR是原核生物基因組內(nèi),一段短的重復(fù)序列,天然存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。在病毒和細(xì)菌的“進(jìn)化斗爭(zhēng)史"過(guò)程中,病毒可以把自身的基因整合到細(xì)菌中,進(jìn)一步利用細(xì)菌的胞內(nèi)“工具",幫助自己完成基因的復(fù)制過(guò)程;而細(xì)菌為了將病毒入侵帶來(lái)的非己基因清除,進(jìn)化出CRISPR-Cas9系統(tǒng)。利用該系統(tǒng),細(xì)菌把病毒基因從自己的基因組上剪切掉。從整個(gè)過(guò)程來(lái)看,CRISPR-Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌的“免疫系統(tǒng)",是抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。

 

CRISPR-Cas9系統(tǒng)包含guide RNA,也被稱為single guide RNAsgRNA,以及有核酸內(nèi)切酶活性的Cas 9蛋白。

 

其中sgRNA包含了與目標(biāo)DNA上特定基因序列互補(bǔ)的一段RNA序列,以及用于識(shí)別Cas9的一段序列。Cas9是一種酶,它充當(dāng)CRISPR系統(tǒng)的剪刀"。Cas9能夠被程序性地引導(dǎo)到目標(biāo)DNA上,并在特定的DNA序列位置切割DNA鏈。

 

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,將sgRNACas9蛋白結(jié)合,形成一個(gè)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物能夠通過(guò)sgRNA的序列精確定位到目標(biāo)基因的位置,并引導(dǎo)Cas9切割目標(biāo)DNA。一旦DNA被切割,細(xì)胞的自身修復(fù)機(jī)制會(huì)介入,修復(fù)DNA損傷。DNA修復(fù)過(guò)程通常涉及兩種主要機(jī)制。非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)通常導(dǎo)致隨機(jī)的插入或刪除DNA片段,從而引起基因突變。同源重組(homology-directed repair,HDR)允許精確地插入新的DNA序列,實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯。

 

CRISPR的成功應(yīng)用,有諸多關(guān)鍵點(diǎn),其中一項(xiàng),就是對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中,核酸污染的控制。在PCR實(shí)驗(yàn)室中,DNA污染很難清除。即使只有一個(gè)污染的DNA分子被檢測(cè)到,也會(huì)使整個(gè)PCR檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)誤差。為確保PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,預(yù)防DNARNA交叉污染,PCR實(shí)驗(yàn)室大多會(huì)常備DNA/RNA污染清除劑。德國(guó)MB公司生產(chǎn)的PCR Clean™,可有效地降解大多數(shù)表面上(輕質(zhì)金屬或有色金屬除外)的擴(kuò)增子,質(zhì)粒或基因組DNARNA。該產(chǎn)品還能有效地去除DNA酶和RNA酶。使用便捷,可直接噴灑在物體表面。保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員,避免接觸DNA污染。非堿性,無(wú)致癌性,成分安全。

 


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